實驗中如何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

實驗中如何選擇二抗

親(qin)和層(ceng)析法純化的二抗

用親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)層(ceng)析(xi)法純化(hua)(hua)的(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)是(shi)(shi)指，利(li)用耦聯到瓊脂糖凝(ning)膠(jiao)上的(de)抗(kang)(kang)原將(jiang)抗(kang)(kang)血清中的(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)層(ceng)析(xi)下來。我們采(cai)用一種*的(de)連續的(de)洗脫過程將(jiang)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)從固態抗(kang)(kang)原上分離(li)出來。我們提供(gong)的(de)未標(biao)(biao)(biao)記的(de)親(qin)(qin)(qin)和(he)(he)層(ceng)析(xi)法純化(hua)(hua)的(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)是(shi)(shi)不含(han)有(you)穩定劑和(he)(he)防(fang)腐(fu)劑的(de)無菌(jun)液體(ti)(ti)(ti)(ti)。耦聯標(biao)(biao)(biao)記物(wu)的(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)是(shi)(shi)凍干粉，里面(mian)含(han)有(you)穩定劑和(he)(he)防(fang)腐(fu)劑，但(dan)是(shi)(shi)過氧(yang)化(hua)(hua)物(wu)酶(mei)標(biao)(biao)(biao)記的(de)抗(kang)(kang)體(ti)(ti)(ti)(ti)里面(mian)不含(han)防(fang)腐(fu)劑。  

親和層析純化抗體的選(xuan)擇和定(ding)位

*步： 選擇 Whole IgG 、 F(ab ’)2 片段，或者(zhe) Fab 片段抗體。 
我們提(ti)供三種(zhong)親和純化(hua)的二抗(kang)： Whole IgG ， F(ab ’)2 片(pian)段(duan)， Fab 片(pian)段(duan)。  

Whole IgG 抗體是從抗血清(qing)中分(fen)離(li)出來(lai)的(de)完整的(de)分(fen)子。這些抗體有一個 Fc 部分和兩個(ge)與抗原結合的(de) Fab 部分，因此是二價的（圖 1 ）。它(ta)的平均分(fen)子量約為 160KD ， Whole IgG 抗(kang)體適用于多數情況，也是(shi)的。

F(ab ’)2 片段   抗體是用胃蛋白酶(mei)消化(hua) IgG 去除 Fc 部分，剩下兩個(ge)靠(kao)二硫鍵連接的結合抗原(yuan)的 Fab 部分，依然是二價(jia)的。（圖 1 ）這抗體用在特定的情況中(zhong)，例如避免抗體與 Protain A 或 G 結合，或者與有 Fc 受體的活細胞結合。但是，如果一(yi)抗是 whole IgG ，不管二抗(kang)是哪(na)種形式都(dou)可能出現結合(he) Fc 受體。這(zhe)時，為了阻止(zhi)抗體結合到 Fc 受體上，可(ke)以在 4 度(du)將細(xi)胞預培養于含有疊氮鈉(na)和二(er)抗來(lai)源物種正(zheng)常血清的緩沖液中。

注意：當使用的是帶標記(ji)的二(er)抗時，千萬不能(neng)用一抗來(lai)源(yuan)物種的正(zheng)常血清(qing)和 IgG 來(lai)封閉(bi)。如果(guo)血(xue)清中(zhong)的(de)免疫球蛋白非特異性(xing)的(de)結合到樣品上(shang)，他(ta)們會被帶(dai)有標記的(de)二抗識別，導致(zhi)背景過(guo)高。

牛血清白(bai)蛋白(bai)（ BSA ）和(he)奶粉是zui為常用的封(feng)閉液，它們(men)可能含有 IgG, 除了牛抗羊 IgG 外，許多二(er)抗(kang)(kang)如(ru)抗(kang)(kang)牛(niu)，抗(kang)(kang)山羊(yang)，抗(kang)(kang)綿羊(yang)與牛(niu) IgG 有(you)較(jiao)強的反(fan)應。因此，使用 BSA 或奶粉封閉(bi)或稀釋(shi)抗體會增加背景(jing)或降低抗體效價。推薦用來自二(er)抗的物(wu)種的正(zheng)常(chang)血清（ 5% v/v ）封閉。

 Fab 片段   抗體是用木瓜蛋白酶消化 IgG 后得到的(de)。這些抗體只含(han)有一個結合位點(dian)（圖 1 ）。它們用(yong)來封閉(bi)內源性的(de)免疫(yi)球蛋(dan)白，或者(zhe)在(zai)使用(yong)相同物(wu)種來源的(de)一抗(kang)作多(duo)標記的(de)實(shi)驗中，用(yong)于封閉(bi)暴露的(de)免疫(yi)球蛋(dan)白。而二價的(de)抗(kang)體（ whole IgG 或 F （ ab’ ） 2 片(pian)段）不能用來封閉，因為(wei)它(ta)們(men)有(you)二個結合(he)位(wei)點。封閉后，一(yi)些(xie)結合(he)位(wei)點可(ke)能為(wei)暴露(lu)出來，與一(yi)抗(kang)結合(he)，從而導致高的背景或假陽性標(biao)記(ji)。

第二步： 在(zai)左(zuo)邊標記(ji)“ antibody description ”的攔里找到一抗的物種來源。

抗體(ti)是根(gen)據一(yi)抗的(de)物種來(lai)源(yuan)的(de)字母(mu)表順(shun)序(xu)排列。比(bi)如(ru)，如(ru)果一(yi)抗是小鼠來(lai)源(yuan)的(de)，就找“ anti-mouse ”。

說明：目(mu)錄中提(ti)供了(le)抗(kang)敘利(li)亞(ya)倉鼠和抗(kang)亞(ya)美尼亞(ya)倉鼠的(de)抗(kang)體。為了(le)正確(que)的(de)選擇(ze)二抗(kang)，必須知(zhi)道一抗(kang)是(shi)在哪種(zhong)倉鼠中制(zhi)備的(de)。

第(di)三步： 在標有“ Host ”這(zhe)一欄中選擇二抗的物種來源。

二(er)(er)抗(kang)的(de)物(wu)(wu)種(zhong)來(lai)(lai)源(yuan)在抗(kang)體描述的(de)開(kai)始(shi)部分，選(xuan)擇二(er)(er)抗(kang)的(de)物(wu)(wu)種(zhong)來(lai)(lai)源(yuan)應(ying)考慮幾點: 1) 個人的(de)取向或經驗。 二(er)(er)抗(kang)的(de)質量(liang)問(wen)題與物(wu)(wu)種(zhong)特異性沒有關系(xi)。2 ）與蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)A 和(he)(he)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)G 結(jie)合。兔抗(kang)體能(neng)很好(hao)地與蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)A 和(he)(he)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)G 結(jie)合，但羊(yang)和(he)(he)猴抗(kang)體能(neng)更好(hao)的(de)與蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)G結(jie)合。 3 ）經(jing)物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)吸附處(chu)理的抗體(ti)可用(yong)性。某些物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)來源的抗體(ti)可能不能被具有交叉反應的物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)進(jin)行吸附處(chu)理。選擇經(jing)過吸附處(chu)理的物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)。4 ）物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)兼(jian)容(rong)性。 在多標(biao)記實(shi)驗中，一(yi)些物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)不能和(he)其(qi)他(ta)物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)兼(jian)容(rong)。一(yi)般地，多標(biao)記二抗必須來自同一(yi)物(wu)(wu)種(zhong)(zhong)。

第四步： 在“ antibody description ” 下面選擇二抗的特異性。

下面(mian)詞語的解(jie)釋將對選擇合適的抗體有所幫助。

注意：不同來源的(de)免疫球蛋白含有相(xiang)似的(de)結構，抗體的(de)生(sheng)成(cheng)過(guo)程(cheng)也相(xiang)似。抗一個物種(zhong)的(de)抗體可能(neng)與其(qi)他物種(zhong)發生(sheng)交叉反應， 除非(fei)特異性的(de)經(jing)過交叉(cha)反(fan)應物種(zhong)的(de)吸附處理。在抗體描述中，經(jing)過其他物種(zhong)的(de)吸附處理的(de)抗體標有“ (min X …Sr Prot) ”字樣 。

Anti-IgG (H+L)

這類(lei)抗體和(he) IgG 分子的(de)重鏈和(he)輕(qing)鏈都可(ke)以反應(ying)，比如，和(he) IgG 分子的 Fc ， F(ab ’)2/Fab 部分。 Anti-IgG (H+L) 抗體(ti)也可以和其他的免疫球蛋白家族（ IgM ， IgA ，IgD,IgE ）和亞家族反應，因為所有(you)的(de)免疫球蛋(dan)白都有(you)相同的(de)輕鏈（或者 κ 鏈，或者 λ 鏈）。 Anti-IgG (H+L) 抗(kang)體比(bi)只抗(kang)片(pian)段的抗(kang)體識別更多的抗(kang)原(yuan)表位，適(shi)合普(pu)通的免疫(yi)檢(jian)查過程。

Anti-IgG ， Fc/ Fc γ fragment specific

這類抗體(ti)和 IgG 重鏈的 Fc 部(bu)分反應。它(ta)們(men)通過(guo) ELISA 檢測，和 / 或(huo)針(zhen)對 Fab 片段吸附(fu)測試。某些情(qing)況(kuang)下(xia)，這(zhe)類抗體(ti)需要(yao)額外(wai)檢測和 / 或(huo)吸收處理來降低 IgM 和 或 IgA 的交叉反應。在這(zhe)種情(qing)況下（ 抗人，抗鼠(shu)和抗大(da)鼠(shu) ），抗體標有(you)“抗IgG （ Fc γ ）”，表示這類抗(kang)體只與(yu) IgG 重鏈反應，通常不能和 IgA 或 IgM 任何(he)表位反應。

注意：不是所(suo)有 anti-IgG, Fc 抗(kang)體(ti)和所(suo)有亞型的 IgG 反應(ying)能力(li)一致。要找和四(si)種(zhong) IgG 亞類反應能力差(cha)不多(duo)的 抗鼠IgG, Fc γ抗體(ti)的話，應(ying)當選羊抗鼠IgG( 亞(ya)類(lei)1+2a +2b+3), Fc γ特(te)異性片段(min X Hu,Bov,Rb Sr Prot) 。

Anti-IgG ， F(ab ’)2 fragment specific

這類抗體和(he) IgG 的(de) F(ab ’)2/Fab 部分反應。它們經過(guo)了 ELISA 和 / 或 Fc 片段的(de)吸(xi)附檢測。它們不是特異性 IgG ，因為它們(men)是(shi)和輕鏈反應的(de)(de)，它們(men)同(tong)時也和具有相同(tong)輕鏈的(de)(de)其他種類的(de)(de)免疫球蛋(dan)白（ Ig D, IgM, IgA 和(he)IgE ）和亞(ya)類反應(ying)。

(min X …Sr Prot)

與(yu)一個物種反(fan)應(ying)的(de)二抗(kang)(kang)可能(neng)與(yu)其(qi)他物種發生(sheng)交叉反(fan)應(ying)，除非這類抗(kang)(kang)體經過(guo)其(qi)他物種的(de)吸收(shou)實(shi)驗。這類抗(kang)(kang)體經過(guo)了檢測，以(yi)及針對(dui) IgG 和圓(yuan)括號中的(de)(de)物種的(de)(de)血清蛋白(bai)的(de)(de)吸附處理。 （標有“ (min X…Prot)” 字樣的(de)抗(kang)體(ti)是(shi)經過了圓括號中所標的(de)物種的(de) IgG 和(he) / 或血清蛋(dan)白的(de)(de)(de)吸(xi)附處(chu)理的(de)(de)(de)）。當其他物(wu)種免(mian)(mian)疫球蛋(dan)白的(de)(de)(de)出現可能導(dao)致交叉(cha)反應時，推薦使用這(zhe)類抗體。但是，當要(yao)(yao)選擇(ze)經過針對相近物(wu)種吸(xi)附處(chu)理的(de)(de)(de)抗體時，要(yao)(yao)特別注意，因為它們(men)能識別的(de)(de)(de)表位數量大(da)大(da)減小了(le)，可能識別單抗的(de)(de)(de)能力很(hen)弱。例如，在含有內源性免(mian)(mian)疫球蛋(dan)白的(de)(de)(de)大(da)鼠的(de)(de)(de)組織樣(yang)本中，只用經大(da)鼠 IgG 吸附(fu)處(chu)理的抗(kang)鼠 IgG 檢測大(da)鼠組(zu)織中(zhong)的鼠源一(yi)抗(kang)(kang)，或者在多標記實驗中(zhong)使(shi)用了大(da)鼠的一(yi)抗(kang)(kang)。另(ling)個(ge)(ge)一(yi)個(ge)(ge)例子是抗(kang)(kang)大(da)鼠 IgG(min X Mouse… Sr Prot) 和(he)抗敘(xu)利(li)亞倉鼠(shu) IgG （ min X….Mouse, Rat Sr Prot ）。

實驗中如(ru)何選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

以下是圓括(kuo)號中所使(shi)用的一些(xie)簡稱：

Bov = Bovine
      Ck = Chicken
      Gt = Goat
      GP = Guinea Pig
      Sy Hms = Syrian Hamster
      Hrs = Horse
      Hu = Human
      Ms = Mouse
      Rb = Rabbit
      Shp = Sheep
      Sw = Swine
      Sr = Serum
      Prot = Protein.

ML （ Multiple Labeling ）

有些抗(kang)體(ti)標明了“ ML ” ，來強(qiang)調(diao)它(ta)們(men)除了可以用(yong)于單標，還(huan)可用(yong)于多(duo)標記(ji)實(shi)驗。

抗(kang)亞美尼亞倉(cang)鼠IgG 和(he)抗(kang)敘利亞倉(cang)鼠IgG

大部分倉(cang)(cang)鼠單(dan)克(ke)隆抗(kang)體是來(lai)原于亞(ya)(ya)美(mei)尼(ni)亞(ya)(ya)倉(cang)(cang)鼠的脾(pi)臟細胞(bao)和鼠骨髓瘤細胞(bao)的雜交瘤細胞(bao)，它(ta)是亞(ya)(ya)美(mei)尼(ni)亞(ya)(ya)（而(er)不是敘利(li)(li)亞(ya)(ya)）倉(cang)(cang)鼠IgG. 許多(duo)商業化的多(duo)克(ke)隆抗(kang)倉(cang)(cang)鼠IgG 是抗(kang)敘利(li)(li)亞(ya)(ya)倉(cang)(cang)鼠IgG, 這種抗(kang)體在檢測亞(ya)(ya)美(mei)尼(ni)亞(ya)(ya)倉(cang)(cang)鼠IgG 單(dan)克(ke)隆抗(kang)體時，它(ta)的效果沒有抗(kang)亞(ya)(ya)美(mei)尼(ni)亞(ya)(ya)倉(cang)(cang)鼠IgG 好。

注意：抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X Bov, Hu, Ms , Rb, Rat Sr Prot) 不能識別所有的亞美尼亞倉鼠單克隆抗體，因為它經相近物種的吸附處理過（粗體字）。因此，使用經過少數物種或少數相近物種的吸附處理過的抗體可達到較好的效果，如抗亞美尼亞倉鼠IgG(H+L)(min X BoV Sr Prot), 除此之外，在小鼠或大鼠免疫球蛋白中也應該檢測亞美尼亞倉鼠單抗。

第五步： 從表格(ge)頂(ding)部選(xuan)擇需要(yao)的探針。

關(guan)于(yu)探(tan)針的技術(shu)信息參考其(qi)他網頁。

第六步： 在 antibody description 一行和(he)探針欄(lan)相交處，找到選擇的抗體的價錢、規格和(he)目錄號。

每個方格頂部的(de)(de)數字(zi)是每單位的(de)(de)價(jia)錢，底(di)部的(de)(de) 9 位數(shu)字為目錄號(hao)。

第七步： 以定購目的查看(kan)產(chan)品(pin)說明

為(wei)了避免錯誤，產品說明應該遵循(xun)一個特定(ding)的(de)語法排列。比如，目錄號為(wei) 115 － 096 － 072 的產品應當描述為：

FITC-conjugated  |	AffiniPure |	F(ab)2 fragment  |	of Goat |	Anti-Mouse  |	IgG, F(ab)2 fragment specific  |
A	B	C	D	E	F
(minimal cross-reactivity to human, bovine, and horse serum proteins)  |
G

A.       耦聯的探針說明，如(ru)熒光素，酶，生物(wu)素等(deng)。如(ru)果抗體沒有耦聯，不用寫。

B .      抗(kang)體純化是(shi)商標名字，是(shi)指從抗(kang)血清中通過偶聯瓊脂(zhi)糖的抗(kang)原免(mian)疫層(ceng)析的方法分離得到的抗(kang)體。

C ．抗體的形式(shi)－ 完整IgG, 或者(zhe) F(ab ’)2 、 Fab 片段。

D.      抗(kang)體來源物種名稱。

E ．     和該(gai)抗(kang)體反(fan)應的物種名稱(cheng)。

F.     抗體特異性描述。

G.      經過(guo)吸(xi)附處(chu)理以后減小了交叉反應的物種名稱。  

實驗中如(ru)何(he)選擇Jackson ImmunoResearch 二抗

 

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